类器官（Organoid）是由干细胞或组织碎片在体外三维培养条件下自组织形成的微型器官模型，能够模拟体内器官的结构和功能。其培养实验流程涵盖细胞获取、三维培养体系构建、诱导分化、功能验证及长期维护等关键步骤。以下是详细的类器官培养实验流程及注意事项：
一、实验前准备
1.材料与试剂
细胞来源：成体干细胞（如肠道隐窝干细胞、肝祖细胞）、诱导多能干细胞（iPSCs）或胚胎干细胞（ESCs）。
培养基：基础培养基（如Advanced DMEM/F12）补充生长因子（EGF、Noggin、R-spondin1等）、抗生素（青霉素/链霉素）、谷氨酰胺及B27补充剂。
基质胶：Matrigel或人工合成水凝胶（如Geltrex），用于提供三维支撑。
其他试剂：胶原酶、Dispase、TrypLE（细胞消化液）、PBS、4%多聚甲醛（固定液）。
2.设备与耗材
细胞培养箱（37℃、5% CO₂）、低温离心机、显微镜、移液器、24孔/48孔培养板、无菌操作台。
二、类器官培养实验流程
1. 细胞获取与分离
成体干细胞分离（以肠道类器官为例）：
组织处理：取小鼠或人肠道组织，用PBS冲洗后剪碎，加入胶原酶（2 mg/mL）或Dispase（1 U/mL）37℃消化30-60分钟，直至形成单细胞悬液。
隐窝分离：通过密度梯度离心或过滤（70 μm滤网）分离肠道隐窝，隐窝是类器官形成的起始单位。
iPSCs/ESCs分离：
从已建立的干细胞系中消化获取单细胞，悬浮培养形成胚胎体（Embryoid Bodies, EBs），再诱导分化为特定谱系细胞。
2. 三维基质胶包被
基质胶准备：将Matrigel于4℃解冻，按1:10比例与预冷的基础培养基混合（避免气泡产生）。
包被培养板：每孔加入50-100 μL基质胶混合液，37℃孵育30分钟使其凝固，形成三维支撑结构。
3. 类器官接种与初始培养
细胞接种：将分离的隐窝或干细胞（500-1000个/孔）悬浮于50 μL培养基中，均匀滴加至基质胶表面，37℃静置15分钟使细胞沉降。
覆盖培养基：轻柔加入预热的完全培养基（500 μL/孔），避免冲散细胞。
4. 诱导分化与培养基更换
分化条件：根据器官类型调整培养基成分：
肠道类器官：补充EGF（50 ng/mL）、Noggin（100 ng/mL）、R-spondin1（500 ng/mL）促进隐窝增殖。
肝类器官：添加HGF（20 ng/mL）、Oncostatin M（10 ng/mL）诱导肝芽形成。
脑类器官：使用无血清培养基（Neurobasal）补充FGF2、BDNF，促进神经分化。
培养基更换：每3-4天半量更换培养基，避免类器官脱离基质胶。
5. 类器官扩增与传代
传代时机：当类器官直径达200-500 μm时（约7-14天），需进行传代以维持活性。
传代步骤：
吸除旧培养基，用冷PBS冲洗2次。
加入基质胶消化液（如Dispase，2 mg/mL）37℃孵育20-30分钟，直至基质胶溶解。
收集类器官至15 mL离心管，500×g离心5分钟，弃上清。
用TrypLE或Accutase于37℃消化5-10分钟，形成单细胞或小团块。
离心后重悬于新鲜基质胶中，按1:3比例传代至新培养板。
6. 功能验证与检测
形态学观察：显微镜下记录类器官生长情况（如肠道类器官的囊状结构、肝类器官的胆汁管形成）。
免疫荧光染色：检测器官特异性标记物（如肠道类器官的LGR5、肝类器官的HNF4α）。
功能分析：
肠道类器官：检测刷状缘酶活性（如碱性磷酸酶）。
肝类器官：测定白蛋白分泌量或尿素合成能力。
脑类器官：评估电生理活性（如钙成像）或神经元突触形成。
三、关键注意事项
1.无菌操作：全程在无菌操作台中进行，避免细菌/真菌污染。
2.基质胶质量：使用低生长因子基质胶，避免干扰类器官分化。
3.温度控制：基质胶需4℃保存，解冻后分装使用，防止反复冻融。
4.细胞密度：接种密度过高会导致营养竞争，过低则难以形成类器官。
5.分化因子浓度：需根据类器官类型优化生长因子组合（如Wnt通路激活剂对肠道类器官至关重要）。
四、应用场景
疾病模型：构建肿瘤类器官（如结直肠癌、胰腺癌）用于药物筛选。
再生医学：研究肝、肾类器官的移植潜力。
发育生物学：解析器官发生机制（如脑类器官模拟皮质层形成）。
毒理学测试：评估化学物质对器官的毒性效应。
五、常见问题与解决方案
类器官不形成：检查基质胶是否凝固完全，或调整细胞接种密度。
生长缓慢：补充生长因子或更换新鲜培养基。
污染：立即丢弃污染培养物，彻底消毒操作台。
传代后死亡：优化消化时间，避免过度机械损伤。
通过规范化的实验流程与严格的质量控制，类器官培养可高效模拟体内器官的生理与病理状态，为生物医学研究提供强大的体外模型。
