悬浮细胞（如淋巴细胞、造血干细胞、肿瘤细胞系）因无贴壁依赖的生长特性，在体外培养中易受营养耗竭、代谢废物堆积或环境应激影响产生死细胞。死细胞释放的核酸碎片、胞内蛋白不仅污染培养体系，还会干扰细胞活性检测、分选及功能实验结果，甚至引发活细胞凋亡。因此，高效、低损伤地去除悬浮细胞中的死细胞，是细胞生物学研究、细胞治疗及药物研发的关键环节。本文系统梳理主流去除技术的核心原理、操作要点与适用场景，为实验设计提供科学参考。
一、密度梯度离心：基于密度差异的经典分离法
密度梯度离心是利用活细胞与死细胞密度差异实现分离的传统技术，核心逻辑是通过梯度介质构建密度梯度，使不同密度的细胞在离心力作用下迁移至对应密度层，从而实现分离。其技术成熟度高、成本低，是大规模悬浮细胞纯化的首选方案。
1. 核心原理与介质选择
活细胞因胞膜完整、胞质成分均一，密度通常维持在 1.05~1.07 g/cm³；死细胞因胞膜破损、内容物流失或吸水肿胀，密度降至 1.02~1.04 g/cm³，或因脱水皱缩密度异常升高。常用梯度介质分为两类：
Ficoll-Paque：密度固定为 1.077 g/cm³，渗透压较高（约 340 mOsm/kg），适用于外周血单个核细胞（PBMC）、淋巴细胞等耐受度较高的细胞分离；
Percoll：可通过稀释调节密度（1.000~1.130 g/cm³），渗透压与细胞内环境接近（280~320 mOsm/kg），更适合干细胞、敏感肿瘤细胞等脆弱细胞的纯化。
2. 操作流程与关键控制
以 PBMC 分离为例，典型操作步骤为：将细胞悬液与 Ficoll-Paque 按 1:1 体积缓慢叠加（避免混合），室温下以 400×g 离心 30 分钟，离心后体系形成四层 —— 上层为血浆 / 培养基（含死细胞与细胞碎片），中层为 Ficoll-Paque，下层为红细胞 / 粒细胞沉淀，活细胞则富集于中层与下层的界面。需注意：离心转速不可超过 500×g（避免活细胞损伤），Ficoll-Paque 分离后需用生理盐水洗涤 2~3 次（去除残留介质，降低渗透压损伤风险）。
3. 优势与局限
该方法单次可处理 10⁷~10⁸个细胞，活细胞回收率达 80% 以上，适合大规模样本的初步纯化；但对密度接近活细胞的早期凋亡细胞分离效果有限，且 Ficoll-Paque 的高渗透压可能导致敏感细胞活性下降。
二、免疫磁珠分选：基于表面标志物的特异性去除
免疫磁珠分选（MACS）利用死细胞表面特有的抗原标志物（如磷脂酰丝氨酸、坏死细胞特异性蛋白），通过抗体 - 磁珠复合物实现靶向捕获，核心优势是特异性高（仅识别死细胞）、对活细胞损伤小（活性影响 < 5%），适用于高纯度需求场景。
1. 靶点选择与技术原理
最常用的靶点为磷脂酰丝氨酸（PS） —— 活细胞的 PS 仅分布于胞膜内侧，死细胞（尤其是早期凋亡细胞）因胞膜外翻使 PS 暴露于表面。将偶联抗 PS 单克隆抗体的磁性微球（直径 50~100 nm）与细胞悬液在 4℃孵育 15~20 分钟，死细胞通过 PS 与抗体结合磁珠后，置于磁场中被吸附在管壁，活细胞随上清液收集。此外，针对完全坏死的细胞，可选择靶向 “坏死细胞特异性 DNA 片段” 或 “损伤胞膜蛋白” 的磁珠，进一步提升分离精度。
2. 操作要点与性能指标
孵育过程需严格控制温度（4℃可减少非特异性结合），磁珠浓度需根据死细胞比例优化（通常为 1×10⁷细胞加入 5 μL 磁珠），避免过量磁珠导致活细胞非特异性吸附。该技术可将死细胞比例从 30% 以上降至 5% 以下，活细胞增殖能力与功能不受影响，尤其适合 CAR-T 细胞制备、干细胞诱导分化等对细胞纯度要求严苛的场景。
3. 优势与局限
特异性与低损伤性是其核心亮点，但单次处理细胞量通常不超过 10⁷个，且磁珠与抗体成本较高，更适合中小规模样本的精细化纯化。
三、过滤法与流式细胞术：从快速筛选到高精度分选
针对不同实验需求，还可选择基于物理特性的过滤法，或基于多参数的流式细胞术，实现死细胞的快速去除或高精度分选。
1. 过滤法：快速物理筛选
悬浮细胞中，死细胞因胞膜破损易发生肿胀（直径增大 20%~30%）或皱缩（直径减小 15%~20%），而活细胞大小均一（通常 10~20 μm）。利用孔径 70~100 μm 的尼龙网或聚碳酸酯膜过滤，可拦截过大的肿胀死细胞与碎片；若需去除过小的皱缩死细胞，可采用 “两步过滤法”—— 先通过 100 μm 筛网去除大杂质，再通过 40 μm 筛网保留活细胞。该方法操作仅需 5~10 分钟，无化学试剂干扰，适用于病毒感染后细胞样本等紧急实验的快速预处理，但特异性低，若活细胞与死细胞大小重叠（如小体积凋亡细胞），活细胞回收率仅 60%~70%，仅适合对纯度要求不高的场景。
2. 流式细胞术：高精度多参数分选
流式细胞术（FCM）通过荧光染料区分活死细胞，实现 “多参数筛选 + 单细胞分选”，是目前纯度最高的去除技术（活细胞纯度可达 99% 以上）。常用双荧光标记策略：活细胞染料 Calcein-AM 进入细胞后被酯酶水解发出绿色荧光，死细胞染料 PI 仅穿透破损胞膜与 DNA 结合发出红色荧光。仪器通过激光检测荧光信号，仅收集 “Calcein-AM 阳性、PI 阴性” 的活细胞，同时可结合细胞大小、颗粒度等参数排除异常细胞。该方法适合稀有细胞（如循环肿瘤细胞、造血干细胞）的纯化，但设备成本高（需流式分选仪）、处理量小（单次最大 10⁶个细胞），且激光照射可能轻微影响免疫细胞活化状态，分选后需通过 CCK-8 法或功能实验验证活性。
四、技术选择策略与关键注意事项
选择死细胞去除技术时，需综合三大核心因素：
细胞类型：脆弱细胞（如干细胞）优先选 Percoll 密度梯度离心或免疫磁珠分选，耐受细胞（如 PBMC）可选 Ficoll-Paque；
样本规模：大规模样本（>10⁷个细胞）选密度梯度离心，中小规模高纯度需求选免疫磁珠，稀有细胞选流式细胞术；
实验成本：预算有限的常规实验选过滤法或密度梯度离心，精细化研究或临床应用选免疫磁珠或流式。
此外，需注意三大操作要点：一是全程无菌操作，避免污染；二是处理前后用台盼蓝或荧光染料检测死细胞比例，验证去除效果；三是对纯化后的活细胞进行活性验证（如增殖实验、功能检测），确保技术过程未影响细胞功能。
总结
悬浮细胞死细胞去除技术已形成 “经典方法 + 精准技术” 的多层次体系，从密度梯度离心的大规模分离，到免疫磁珠的特异性去除，再到流式细胞术的高精度分选，可满足不同实验场景需求。未来，随着微流控技术的发展，有望开发出 “高通量、低损伤、自动化” 的集成系统，进一步推动悬浮细胞在基础研究（如细胞互作机制）与临床应用（如细胞治疗）中的转化落地。
