活细胞分析仪通过自动化成像、环境控制与智能分析技术，可系统追踪小鼠胚胎卵母细胞焦亡过程，其核心流程与功能如下：

一、实验设计：动态追踪焦亡过程

1.样本准备

将小鼠胚胎卵母细胞接种于培养皿或微孔板中，置于活细胞分析仪的培养箱内（37℃、5% CO₂），避免频繁取出导致的环境干扰。

2.诱导焦亡

通过药物（如LPS、化疗药物）或基因编辑（如敲除/过表达焦亡相关基因）诱导细胞焦亡，模拟生理或病理状态。

3.定时成像

设置活细胞分析仪的拍摄间隔（如每30分钟或1小时），连续记录72小时以上的细胞动态变化，捕捉焦亡的关键事件（如膜起泡、破裂）。

二、多模态成像：捕捉焦亡形态特征

1.明场成像

细胞肿胀与膜破裂：光镜下观察细胞体积增大、气泡状突起（焦亡小体）及膜完整性丧失。

运动轨迹：记录细胞迁移或群体行为变化，分析焦亡对胚胎发育的影响。

2.荧光成像

膜标记：用钙黄绿素-AM标记活细胞质，Annexin V-FITC标记早期焦亡细胞膜外翻的磷脂酰丝氨酸。

核标记：Hoechst 33342标记细胞核，观察核浓缩、DNA断裂等特征。

炎症因子标记：抗IL-1β-Alexa Fluor 647抗体标记释放的促炎因子，直观显示炎症反应。

3.三维Z轴堆叠

通过电动Z轴控制重建细胞或胚胎的三维结构，分析焦亡过程中细胞内部器官（如线粒体、内质网）的肿胀与破裂。

三、智能分析：量化焦亡参数

1.形态学分析

AI识别：自动识别细胞边界、焦亡小体数量及膜破裂时间。

面积变化率：计算细胞面积随时间的变化，量化肿胀程度。

运动轨迹追踪：分析细胞迁移路径，评估焦亡对胚胎动态的影响。

2.生化特征分析

炎症小体激活：通过荧光信号定量检测NLRP3、ASC等炎症小体组件的组装。

Caspase活化：Western Blot或荧光探针检测Caspase-1/4/5/11的切割与激活。

Gasdermin蛋白切割：检测GSDMD/GSDME的N端片段生成，确认膜孔道形成。

3.炎症因子释放

ELISA检测：定量分析培养上清中IL-1β、IL-18的浓度，评估炎症反应强度。

多因子检测：利用Luminex或MSD技术同时检测多种炎症因子，提高通量。

四、经典与非经典通路解析

1.经典通路（Caspase-1依赖）

炎症小体激活：NLRP3识别病原体或危险信号，招募ASC与Caspase-1形成复合体。

Caspase-1切割：激活后切割GSDMD，产生N端片段形成膜孔道，导致细胞肿胀破裂。

炎症因子释放：切割IL-1β/IL-18前体，成熟后释放至细胞外，招募免疫细胞。

2.非经典通路（Caspase-4/5/11依赖）

直接LPS识别：人源Caspase-4/5或鼠源Caspase-11直接结合细菌LPS，被激活后切割GSDMD。

间接Caspase-1激活：非经典通路可间接激活Caspase-1，放大炎症反应。

Pannexin-1剪切：Caspase-11剪切Pannexin-1，诱导ATP释放，进一步加剧焦亡。

五、应用场景与优势

1.胚胎发育研究

追踪焦亡对胚胎植入前发育的影响，分析染色体分离异常与胚胎质量的关系。

评估卵巢刺激对卵母细胞焦亡发生率的影响，优化辅助生殖技术。

2.疾病机制研究

感染性疾病：研究病原体诱导的焦亡在抗感染免疫中的作用。

神经退行性疾病：分析小胶质细胞焦亡在阿尔茨海默病中的双重角色（清除病原体 vs. 引发炎症）。

肿瘤免疫：探索化疗药物通过GSDME介导的焦亡在肿瘤清除中的机制。

3.技术优势

长时间连续监测：72小时以上稳定运行，捕捉快速动态过程。

低光毒性设计：红色LED光源减少光损伤，支持长时间成像。

高通量分析：96孔板自动扫描，单次实验处理数百样本。

AI智能分析：自动识别细胞形态、量化参数，减少人为误差。

总结

活细胞小鼠胚胎卵母细胞的细胞焦亡系统，主要依赖炎症小体（如 NLRP3）激活，下游 caspase-1/11 介导信号传递，促使 GSDMD 蛋白穿孔细胞膜，释放促炎因子。该过程与卵母细胞发育阶段相关，氧化损伤、病原体入侵等应激可诱导其发生，参与卵母细胞质量筛选，异常激活则可能影响胚胎发育潜力，是卵母细胞应激响应的重要调控机制。