在肿瘤免疫治疗领域，免疫细胞杀伤动力学的研究始终是破解疗效机制的核心命题。传统方法依赖终点式检测，仅能捕获瞬时状态，而免疫细胞与肿瘤细胞的相互作用本质上是动态过程。活细胞分析仪的出现，尤其是以赛多利斯Incucyte®为代表的实时成像系统，通过非侵入式、长时程监测技术，彻底改变了这一领域的研究范式，为揭示免疫杀伤的时空规律提供了全新视角。

一、技术突破：从“静态快照”到“动态电影”

传统技术如51Cr释放法、LDH检测法及流式细胞术，均需固定细胞或终止培养后进行检测，导致三大局限：

1.时间分辨率缺失：单次检测无法反映杀伤过程的时序性变化；

2.环境干扰显著：频繁取样破坏培养箱微环境，影响细胞行为真实性；

3.功能信息单一：仅能获取细胞死亡率，无法区分凋亡、坏死等死亡方式，更无法追踪免疫突触形成等关键事件。

Incucyte®系统通过集成高分辨率荧光与明场成像模块，直接置于培养箱内，实现每15分钟至数小时的自动连续成像，最长可监测数周。其专利光学设计确保在移动组件时细胞位置固定，避免机械振动干扰；五色荧光通道（支持NIR近红外）可同时标记靶细胞（如NucLight红色核标记）、效应细胞（如CD8+ T细胞用Fabfluor-488绿色标记）及死亡信号（如Caspase-3/7绿色荧光探针），构建多维度动态数据集。

二、应用创新：解析免疫杀伤的四大维度

1. 杀伤时序的精准量化

在约翰霍普金斯大学的研究中，Incucyte®连续120小时追踪T细胞对TP53突变肿瘤细胞的杀伤过程。通过Cell-By-Cell分析软件，研究者发现：

接触依赖性：T细胞需与靶细胞形成稳定接触（平均接触时间2.3小时）后方可诱导死亡；

级联放大效应：单个活化的T细胞可连续杀伤5-8个靶细胞，呈现“死亡之吻”的动态传播；

剂量-时间关系：低浓度双特异性抗体（H2-scDb）需48小时方显杀伤效应，而高浓度组在24小时内即达峰值，揭示抗体亲和力与杀伤速率的非线性关联。

2. 死亡方式的动态区分

传统方法无法区分凋亡与坏死，而Incucyte®通过双荧光标记技术实现实时分类：

早期凋亡：Annexin V橙色荧光标记暴露的磷脂酰丝氨酸；

晚期凋亡/坏死：PI红色荧光标记渗透的细胞核；

免疫突触可视化：Fabfluor-488标记的CD8+ T细胞与靶细胞接触面形成黄色荧光环，直观显示突触动态扩张与收缩。

在ADCC效应研究中，研究者发现曲妥珠单抗诱导的SK-OV-3肿瘤细胞死亡中，72%为早期凋亡，18%为晚期凋亡，10%为直接坏死，揭示抗体依赖性杀伤的复杂机制。

3 3D模型中的杀伤解析

针对肿瘤球体等3D模型，Incucyte®的Z轴层扫功能可重建立体结构，量化杀伤的空间异质性。例如，在A549肿瘤球共培养实验中：

外层细胞优先死亡：T细胞需穿透球体表面才能接触内部细胞，导致外层死亡率比核心区高3.2倍；

代谢梯度影响：球体中心因缺氧呈现酸性环境，抑制T细胞颗粒酶释放，使核心区杀伤效率降低58%。

4. 长期疗效的预测模型

通过持续监测杀伤动力学参数（如初始杀伤速率、平台期存活率、二次杀伤能力），Incucyte®数据可构建预测模型。例如，在CAR-T细胞治疗研究中，发现：

初始杀伤速率>0.8 cells/h的CAR-T细胞群体，其体内扩增能力提高4.3倍；

平台期存活率<15%的共培养体系，对应患者无进展生存期延长6.2个月。

三、技术优势：重塑研究范式

1.高通量兼容性：支持96/384孔板并行检测，单次实验可处理数百个样本；

2.操作极简化：从样本加载到数据分析全自动化，减少人为误差；

3.数据富集度：单次实验生成数千张图像，通过AI算法可提取细胞轨迹、形态变化等深层信息；

4.临床转化桥梁：其数据与患者疗效指标（如ORR、PFS）显著相关，成为连接基础研究与临床应用的关键工具。

四、未来展望：从观察到干预

随着活细胞分析仪与单细胞测序、空间组学技术的融合，研究者正从单纯解析杀伤动力学迈向主动调控。例如，通过实时监测杀伤过程中的细胞因子分泌（如IFN-γ、TNF-α），结合微流控芯片实现局部药物递送，构建“监测-干预”闭环系统。这一方向或将催生新一代智能免疫治疗策略，使活细胞分析仪从研究工具升级为治疗设备。

总结

活细胞分析仪的实时成像技术，不仅揭示了免疫杀伤的动态本质，更重新定义了肿瘤免疫学的研究方法论。从分子机制到临床转化，这一技术正在推动整个领域向更精准、更可控的方向迈进，为最终攻克癌症提供关键科学支撑。